SDS-PAGE 실험 방법

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준비 용액 및 장비

전기영동 전압 장치, 탱크, polyacrylamide gel, running buffer, sample buffer

Bio rad 사의 전기영동 장치

 

용액 및 겔 제조

 

[Gel]

직접 제조하여 이용 가능하지만 분자량 분포가 넓은 샘플을 측정하기 위해 gradient 젤을 구매하여 이용하였다. (bio-rad)

제조 방법은 추후 정리할 예정.

 

 

[Buffer 제조]

 

1. Running buffer(10x) - 250mM Tris, 1.92M glycine, 1% SDS, pH 8.3

제조 레시피(10x)

1. Tris base 30.3g

2. Glycine 144.1g

3. SDS 10g을 diH2O에 녹인 후 부피를 1L까지 맞춘다. (pH 맞추지 않고 진행한다) 

제조한 10x running buffer를 DW와 1:9로 섞어 실험에 이용한다. (ex 10x buffer 100ml + DW 900ml 로 1L 제조)

1x로 제조하여 이용도 가능하다.

제조 후 탱크에 옮기거나 다른 병에 옮길 때 기포가 많이 발생하는 문제가 있기 때문에 이를 고려하여 조심스럽게 따른다. 

 

 

 

2. Sample buffer (2x) - 62.5mM Tris-HCl, pH 6.8, 2% SDS, 25%(v/v) glycerol, 0.01% bromophenol blue, 5% β-mercaptoethanol 또는 DTT

제조 레시피(2x, 30ml)

1. 0.5 M Tris-HCl, pH 6.8 3.75ml

2. 50% Glycerol 15.0ml

3. 1.0% Bromophenol blue 0.3ml

4. 10% SDS 6.0ml을 섞고 DW로 부피를 30ml로 맞춘다. (β-mercaptoethanol 또는 DTT는 실험을 진행할 때 넣어서 진행한다.첨가 후 보관 금지! 제조한 Sample buffer 950ul에 50ul의 비율로 첨가한다.) 

 

 

 

2.1 Sample buffer에 들어가는 0.5 M Tris-HCl, pH 6.8 제조(1L)

1. Tris base 60.6g를 DW 900ml에 녹인 후 HCl로 pH 6.8 맞추기.

2. 1L까지 DW 첨가

3. scale down 하여 진행 가능

 

 

실험 방법

 

 

 Sample 준비

 

1. 분석할 단백질 시료와 reducing agent가 첨가된 sample buffer를 섞는다.

 2x의 sample buffer의 경우는 단백질 시료와 1:1부피, 4x의 경우는 단백질 시료와 1:3으로 섞는다. (단백질 시료의 농도는 실험조건에 따라 적절히 설정)

 

2. 제조한 샘플을 90-95°C에서 5분, 혹은 70°C에서 10분동안 가열한다.

 

 

 

전기영동

 

1. 탱크에 젤을 삽입하고 running buffer를 채운다. 전기영동을 할 때 거는 gel의 개수에 따라 넣는 running buffer 부피 달라짐.

 

2. 젤의 well을 running buffer로 수세한다. 10ul 파이펫을 이용하여 워싱

 

3. 각 well에 샘플을 로딩하고 기준이 될 ladder marker도 로딩.

 

4. 탱크 뚜껑을 닫고 전압 장치와 연결한다. 전압은 100~300V로 다양하게 걸 수 있고 전압이 높을수록 전기영동 시간이 짧아진다. 샘플 조건에 따라 적절한 전압이 다르다. 전압이 너무 강하면 밴드가 휘어지고 불분명하게 나올 수 있다.

 

 

염색 및 탈색

1. 전기영동이 끝난 후 젤을 탱크에서 분리하고 이를 staining solution에 침지한다. (침지 시간은 다양. 1시간 정도 진행)

   Staining solution은 다양한 종류가 있고, 보통 Coomassie G-250을 이용한다. 

 

2. 염색 후 destaining solution으로 수세를 진행한다. (overnight)

 

로딩한 샘플의 단백질 농도가 너무 낮으면 염색이 잘 안되어 밴드를 확인하기 어려울 수 있다. 실험을 통해서 적절한 샘플 농도와 염색 시간을 확인하는 것이 좋다. 

 

 

 

출처: https://www.bio-rad.com/