형광 현미경(fluorescence microscope) 기능 및 원리

형광 현미경이란? 

 

형광을 띠는 것을 이미징 할 수 있는 현미경이다. 

대부분의 물질은 형광을 띠지 않는데, 이런 경우 이 물질에 형광 염료로 염색을 하거나 표지를 달아서 이미징하면

원하는 부분을 형광으로 이미징하여 확인할 수 있다.

주로 세포 이미징에서 많이 사용된다.

 

여기서 형광이란?

바닥 상태의 물질에 에너지가 주입되면 들뜬 상태가 되고 다시 바닥 상태로 변할 때 빛이 방출되게 된다. 이때 들뜬상태에서 다시 돌아가는 에너지 준위까지의 에너지에 맞는 측정 파장의 빛이 방출된다. 

 

 

 

 

형광 현미경 원리

출처: https://microbeonline.com/fluorescence-microscope-principle-types-applications/

 

위 이미지와 같이 형광현미경의 시료대에 시료를 올리고 광원을 켜게 되면 빛이 조사된다. 이때 빛이 excitation filter를 통과해서 측정하고자 하는 파장대의 빛만 통과시킨다. 시료에서 형광염료로 표지된 부분이 빛을 받고 이 빛을 흡수하여 들뜸 상태가 되었다가 다시 바닥 상태로 돌아오며서 흡수한 빛 보다 더 에너지가 낮고 파장이 긴 빛을 방출힌다.(스토크스 이동)

방출된 파장대만을 통과시키는 emission filter를 통과하고 이미징 된다.   

형광현미경에서는 GFP, RFP, DAPI 등 파장 영역대에 따라 다른 형광필터를 이용한다. GFP는 초록색, RFP는 적색, DAPI는 청색으로 이미징이 된다. 형광 필터는 측정하길 원하는 특정 파장대의 빛만 투과시켜주는 장치이다. 각각의 명칭은 각 파장대의 대표적인 형광표지물질이다. GFP(Green Fluorescent Protein), RFP(Red Fluorescent Protein), DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole) 

 

 

이미징 과정에서는 다양한 조건으로 이미지의 퀄리티를 조절할 수 있다.

1. Light(광원)

- 광원은 말그래도 광의 세기이다. 시료에 쏘아주는 여기광의 세기를 조절하는 것이다. 일반적으로 세기를 높이면 형광 신호가 강해지지만 너무 강하게 광을 조사하면 형광물질의 bleaching이 일어날 수 있다.

 

2. Gain(감도)

- 약한 형광신호를 인위적으로 증폭시켜 이미지를 밝게 만들어준다. 따라서 게인값을 높이면 형광신호가 강해지지만 노이즈도 함께 증폭되기 때문에 시료가 없는 배경부분에서도 형광이 나타나 배경이 지저분해진다.

 

3. Exposure(노출 시간)

-  카메라가 시료에서 나오는 형광 빛을 받아들이는 시간이다. 노출 시간이 길수록 이미지가 밝아진다. 형광정도가 약한 경우에 노출시간을 늘리면 시그널이 모여서 더 선명한 이미지를 얻을 수 있다. 그러나 샘플을 이동시키면서 확인할 때 노출 시간이 길면 이미지의 버퍼링이 걸린다. 또한 마찬가지로 장시간 노출되면 bleaching이 일어날 수 있다.